如何研究可变剪接？从筛选到验证，一网打尽

可变剪接alternative splicing, AS是转录后调控的重要方式之一。它让同一个基因能够产生多个转录本和蛋白亚型从而显著扩展基因组的功能输出。过去大家谈基因表达更多关注“这个基因有没有上调下调”但现在越来越多研究者意识到仅仅知道基因表达量还不够还要知道它被剪成了什么样子。可变剪接是什么可参考往期推文写给科研新人10分钟彻底搞懂文献里的Isoform与可变剪接在肿瘤、神经发育、免疫调控和遗传病研究中可变剪接已经不再是附属问题而是可能直接关联机制、分型、预后和治疗反应的重要层面。那么可变剪接究竟该怎么研究1. 初筛技术——短读长RNA-seq在多数课题中首先选择二代转录组测序。它的优势在于通量高、成本相对可控、分析流程成熟特别适合做大样本比较。短读长RNA-seq常见的实验设计比较实验组和对照组的剪接差异在肿瘤与正常组织之间筛选异常AS事件分析不同分期、不同亚型、不同治疗反应中的剪接变化构建差异剪接图谱联合表达数据寻找与剪接相关的调控因子。实际分析时主要关注外显子跳跃exon skipping, ES、可变5剪接位点A5SS、可变3剪接位点A3SS、内含子保留intron retention, IR和互斥外显子MXE这几个经典的剪接事件。1优 势短读长测序最大的优点是适合做筛选和比较。对于肿瘤研究来说它尤其适合大样本队列分析TCGA、GEO等公共数据库挖掘预后模型构建差异剪接事件筛选初步定位候选基因和候选外显子。2局 限短读长RNA-seq的主要局限在于读长短往往只能看到局部接头信息而不容易直接看到完整转录本结构。因此二代RNA-seq更像是剪接事件层面的筛查工具而不是最理想的全长转录本解析工具。案例肝细胞癌队列研究去年克利夫兰医学中心的研究团队发表了一篇研究分析了来自16项研究的787例肝细胞癌HCC肿瘤样本的RNA测序数据以鉴定常见的错误可变剪接事件ASEs。考察了ASEs与HCC病因、进展及功能结构域变化之间的关系。结果发现支持循环上皮细胞中的ASEs用于HCC检测的实用性[1]。图研究设计与分析方案示意图。缩写说明AFP甲胎蛋白ASEs可变剪接事件cASEs循环可变剪接事件[1]。2. 确定完整结构——三代全长转录组如果说二代RNA-seq是“局部拼图”那么三代全长转录组测序更像是“全景图”。三代全长转录组是读长更长可以覆盖完整转录本因此特别适合研究复杂剪接。它最核心的价值是可以直接鉴定全长转录本isoforms发现新的剪接异构体明确不同外显子组合是否共存于同一转录本修正或补充已有注释提高对融合转录本、可变起始位点、可变终止位点的认识等。1优 势相对于短读长RNA-seq全场转录组有如下优势a. 复杂基因的异构体解析b. 新转录本发现c. 机制研究前的结构确认2局 限三代全长转录组并不是万能的。它的主要问题包括成本通常更高通量相对较低对低丰度转录本的覆盖仍可能不足大样本临床队列研究成本压力较大。所以在实际研究中它不是替代二代RNA-seq而是两者结合起来。二代适合广筛三代适合定结构。案例结直肠癌队列研究一篇结直肠癌CRC队列研究78例原发性人类结直肠癌组织及10例相邻正常组织活检标本结合长读长测序和短读长RNA测序探究其转录组复杂性[2]。基于ONT的长读长的核心优势是能拿到全长转录本、看清完整剪接结构所以研究里新东西基本都是它挖出来的A. 转录本全景重构共鉴定90,703个转录本比对到18,024个已知基因和2,796个新位点其中62%是GENCODE v34未注释的新转录本近60%的基因存在两个或更多转录本B. 新剪接异构体的首报比如TIMP1Δ4-5exon 4–5 skip亚型就是长读长首次在CRC里看到的它是选择性跳过第4至第5外显子产生新的转录本C. AS类型的重新认知长读长直接计算七类AS事件SE/A3/A5/AF/AL/RI/MX发现AFalternative first exon可变第一外显子在CRC里占比最高与既往短读长研究结论不同短读长对5端AF检测偏弱D. 新转录本的蛋白证据利用CPTAC公共CRC蛋白质组学TMT10plex MS/MS数据通过肽段光谱匹配证实了大量长读长新转录本能够编码真实存在的蛋白证明它们不是转录噪音E. 融合事件检出4538个融合转录本ARHGEF3-CNTNAP2、A2MP1-PTMA等在CRC里较频发。总结长读长干的是定性发现的活新转录本、新isoform、完整AS结构、融合这些是短读长拼不全的。图结直肠癌中可变剪接事件的鉴定。短读长在研究中也比较重要主要承担定量统计推断校正的角色A. 矫正长读长的剪接连接splice junctionONT单碱基错误率相对于二代测序高一些文章用短读长“≥3 uniquely mapped reads支持”作为junction有效的硬阈值“FLAIR correct”和“SQANTI3质控”都依赖短读长兜底 。B. 定量PSI与差异ASDEASSUPPA2软件基于长读长GTF转录本注释定义AS事件但PSIpercent spliced-in反映剪切水平的指标是用短读长StringTie的转录水平表达矩阵算的最终筛出25,002个DEAS|ΔPSI|≥0.2, adjP≤0.05其中1472个与CRC预后显著相关。C. 剪接因子SF差异表达与调控网络利用DESeq2软件筛出17个差异SF如SRSF1在肿瘤上调再对SF表达水平与DEAS事件进行Spearman相关性分析分析利用Cytoscape构建调控异常网络。D. 临床关联分析临床分期III vs IIIIV分析鉴定出998个差异表达的可变剪接事件远处转移样本中有596个DEAS事件上调/583下调表达E. TIMP1-FL vs Δ4-5的表达验证短读长定量确认TIMP1-FL的mRNA表达水平在癌中上调、Δ4-5下调且与生存挂钩FL高→差预后Δ4-5高→好预后。 短读长干的是“定量统计”的活PSI、DEAS、SF表达、临床分层、生存关联——样本多、定量准、统计稳。3. 验证技术——RT-PCR无论是二代筛选到的差异剪接事件还是三代发现的新异构体最后通常都要落到实验验证。最常见的验证手段仍然是RT-PCR、qRT-PCR和Sanger测序等。RT-PCR验证最常用提取样本的RNA反转录为cDNA根据预测的剪切位点设计特异性引物进行PCR扩增通过琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。不同剪切异构体因包含/排除的片段不同会呈现不同的条带通过条带大小和亮度可直观判断剪切形式及相对丰度。若需精确鉴定剪接点可对PCR产物进行Sanger测序。常见验证思路对于某个外显子跳跃事件常见做法是设计引物跨越上下游外显子扩增出包含型和跳跃型两条产物再通过条带大小、测序或定量分析进行验证。所以在很多课题里的技术流程是先用RNA-seq初筛候选事件然后RT-PCR验证剪接形式qPCR定量不同亚型比例。RT-PCR的优势是便宜、快速、直观、适合验证局限是低通量、定量有限、容易有扩增偏倚且难解析复杂转录本结构。案例花鲈盐度调节机制利用长读长转录组对花鲈进行转录组图谱构建为了验证发现的异构体的准确性随机选取了10个AS事件进行RT-PCR验证。引物针对同一基因不同转录本的重叠区域。实验结果表明扩增产物与Iso-seq预测的目标片段一致[3]。图通过RT-PCR验证可变剪接AS事件。上图基因名称、基因ID及转录本ID显示在基因模型左侧不同转录本的剪接事件以连接外显子的红色或蓝色线条表示绿色箭头标示PCR引物位置F为正向引物R为反向引物内含子用黑色线条表示。在琼脂糖凝胶电泳图像中红色或蓝色箭头指示由相应转录本扩增产生的PCR产物。本期我们主要介绍了从筛选到验证的可变剪接研究技术RNA-seq、全长转录组和RT-PCR。此外还有些研究会涉及调控可变剪接可以用到的技术有RIP某个剪接因子是否直接结合目标RNA、Minigene报告系统、与表观机制的串扰ChIP-seq/CUTTag/ATAC-seq等。参考文献【1】Hershberger C E, Daniels N J, Patterson W M, et al. The alternative splicing landscape of hepatocellular carcinoma and its potential for HCC detection[J]. Hepatology Communications, 2025, 10(1): e0838.【2】Sun Q, Han Y, He J, et al. Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer[J]. Genome Medicine, 2023, 15(1): 76.【3】Tian Y, Wen H, Qi X, et al. Characterization of full-length transcriptome sequences and splice variants of Lateolabrax maculatus by single-molecule long-read sequencing and their involvement in salinity regulation[J]. Frontiers in genetics, 2019, 10: 1126.文章含有部分AI生成内容如有错漏/侵权请联系作者删除。